Enraizamiento y aclimatación de plantas obtenidas in vitro
 
Las características anatómicas y fisiológicas de las plantas micropropagadas hacen necesaria para su supervivencia en condiciones ex vitro, una gradual adaptación o aclimatación a las condiciones medioambientales del invernadero o del campo.

La última fase del proceso de micropropagación, llamada Fase 3, incluye los procesos de enraizamiento de la microestaquillas obtenidas en la Fase 2 de multiplicación y su aclimatación a las condiciones ex vitro.

Es una práctica corriente realizar in vitro el enraizamiento de la microestaquillas, pero esto produce problemas en muchas ocasiones. Así, Grout y Aston [Hort. Res., 17, 1 (1977)] observaron como tras el enraizamiento in vitro de sus plantas la zona de transición entre la raíz y el tallo era anormal, con unas conexiones vasculares débiles y malformadas, lo que producía problemas en la absorción y circulación de agua desde las raíces al tallo. Esta disfunción se corrige, al menos parcialmente, tras una adecuada aclimatación. En otras ocasiones el problema estriba en que las raíces que crecen en agar son defectuosas, carecen de pelos radicales y suelen necrosarse al transplantar las plántulas, lo que provoca una parada en el crecimiento de la planta [(Deberg y Maene, Scientia Hort., 14, 335 (1981)]. Tambien se ha observado como las raíces formadas in vitro eran gruesas y con pelos radicales engrosados y anormales, siendo sus sistemas vasculares anómalos, en comparación con raíces formadas en un sustrato arenoso. En las raíces que no mueren durante el proceso de transplante se producen nuevas raíces laterales y adventicias normales durante el proceso de aclimatación y estas ya crecen activamente. Por ello la razón raíz : tallo siempre es más alta en plantas enraizadas ex vitro que in vitro.

Todos estos factores hacen que muchos de los laboratorios que trabajan produciendo plantas in vitro, no realicen el enraizamiento de la microestaquillas in vitro, al resultar problemático, difícil y caro, ya que el proceso de enraizamiento in vitro se estima que implica un costo de entre el 35-75% del coste total de la micropropagación. Por supuesto, no es posible generalizar, ya que la elección del método de enraizamiento va a depender totalmente de la especie y de sus características: porcentajes de enraizamiento y supervivencia final, que varían enormemente de unas especies a otras. Así, cuando el enraizamiento y aclimatación se pueden realizar simultáneamente, sin que haya demasiada pérdida de plantas, tanto los costes como la eficiencia de la producción se ven muy favorecidas.

Entre los factores a considerar en el enraizamiento de microestaquillas tanto in vitro como ex vitro están el tamaño de la microestaquilla, su cobertura foliar, los reguladores de crecimiento utilizados en la inducción, y las condiciones medioambientales de temperatura, luz y humedad.

Algunos autores [(Welander, Physiol. Plant. 58:231, (1983); Zimmerman y Fordham, J. Amer. Soc. Hort. Sci. 110: 34 (1985)] han propuesto una técnica híbrida, que combina las ventajas del enraizamiento in vitro y ex vitro. Para ello las microestaquillas son incubadas inicialmente en un medio estéril que incluye hormonas para la inducción de raíces y azúcares, durante un periodo de 3 a 7 días, para la inducción-inicio de las raíces. Esto se puede hacer en un medio sólido o líquido normalmente en oscuridad. Luego el material es repicado en un medio no estéril, o incluso transplantado a tierra, para la fase de elongación y desarrollo de las raíces, mejorándose de esta forma en muchos casos el resultado final de aclimatación y supervivencia.

Otros autores [(Driver y Shutle, Eds., Cell and Tissue Culture in Forestry Vol. II (1987)] proponen realizar el enraizamiento y la aclimatación simultáneamente, transplantando las microestaquillas directamente en el campo, despues de una etapa previa de endurecimiento in vitro: tras la inducción del enraizamiento, las plantas aún en condiciones in vitro eran sometidas a una elevada intensidad luminosa, un fotoperiodo más corto y una temperatura inferior a la normal, durante un par de semanas. Esto favorecía la lignificación y el desarrollo cuticular y estomático del material y permitía su transplante directo al campo en condiciones controladas de humedad, luz y nutrientes (Minitúnel).

En la fase de aclimatación se pretende que las plantas que han crecido in vitro y por lo tanto sólo han estado expuestas a un microambiente escogido por ofrecer unas condiciones mínimas de estrés y cuasi óptimas condiciones para la multiplicación de las plantas, se adapten a condiciones ex vitro donde las condiciones no son asépticas, ni la luz, temperatura y humedad están controladas, y donde el crecimiento ha ser autotrófico y no heterotrófico como in vitro. Es pues necesario reconstruir y desarrollar los sistemas que por adaptación a la condiciones in vitro, es el caso de la lignificación , cubiertas cuticulares, estomas y estructuras fotosintéticas.

Todas estas deficiencias o disfunciones provocadas por o durante la incubación in vitro es necesario corregirlas de forma gradual, e incluso como ya hemos citados comenzar la adaptación en condiciones in vitro, incluso induciendo fotoautotrofía in vitro mediante incrementos de la tasa de CO2 y de irradiancia en los contenedores de cultivo, al objeto de mejorar la calidad de la planta, los niveles de producción y los costes del proceso de micropropagación.